Il Southern blot, inventato da Edwin Southern, è una tecnica di biologia molecolare utilizzata per rilevare una sequenza di DNA specifica all'interno di un campione. Consiste in una serie di passaggi che consentono di identificare e visualizzare frammenti di DNA che corrispondono a una sonda specifica.
Principio generale:
Il Southern blot si basa sull'ibridazione di una sonda di DNA marcata a una sequenza complementare presente nel DNA genomico del campione. Permette di determinare la dimensione e l'abbondanza della sequenza bersaglio.
Fasi chiave:
Digestione del DNA: Il DNA genomico viene digerito con enzimi di restrizione, generando frammenti di DNA di diverse dimensioni. Questi frammenti riflettono la posizione dei siti di restrizione rispetto alla sequenza di DNA che si vuole analizzare.
Elettroforesi su gel: I frammenti di DNA digeriti vengono separati in base alle dimensioni mediante elettroforesi su gel di agarosio. Le molecole di DNA più piccole migrano più velocemente attraverso il gel rispetto a quelle più grandi.
Trasferimento (Blotting): Il DNA separato viene trasferito dal gel a una membrana di nitrocellulosa o nylon. Questo passaggio è cruciale perché il gel è fragile e difficile da manipolare. La membrana, invece, è più robusta e permette di legare il DNA in modo permanente. Questo processo viene definito "blotting".
Ibridazione: La membrana viene incubata con una sonda di DNA marcata (radioattivamente o con altri marcatori). La sonda è una sequenza di DNA a singolo filamento complementare alla sequenza di DNA bersaglio che si sta cercando. La sonda si legherà (ibridizzerà) alla sequenza complementare sulla membrana. Questo processo è influenzato da fattori come la temperatura e la concentrazione salina.
Lavaggio: La membrana viene lavata per rimuovere la sonda non legata.
Visualizzazione: La sonda legata viene visualizzata. Se la sonda è radioattiva, si utilizza l'autoradiografia. Se la sonda è marcata con un altro metodo (ad esempio, con un enzima), si utilizza un metodo di rilevazione appropriato (ad esempio, una reazione colorimetrica).
Applicazioni:
Rilevamento di specifiche sequenze di DNA: Individuare la presenza di un gene o di una specifica sequenza ripetuta.
Analisi del polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP): Rilevare differenze nel DNA tra individui basate sulla variazione della lunghezza dei frammenti prodotti dalla digestione con enzimi di restrizione. Questo è utile per la tipizzazione del DNA e gli studi di linkage genetico. Vedi https://it.wikiwhat.page/kavramlar/RFLP.
Mappatura genica: Determinare la posizione di un gene sul cromosoma.
Diagnosi di malattie genetiche: Rilevare mutazioni o delezioni in geni specifici.
Identificazione di organismi transgenici: Confermare l'inserimento di un transgene nel genoma di un organismo.
Analisi del numero di copie geniche: Determinare quante copie di un gene specifico sono presenti in un genoma.
Vantaggi:
Svantaggi:
Alternative moderne:
Tecniche più moderne, come la PCR (reazione a catena della polimerasi) e la sequenziamento del DNA, hanno in gran parte sostituito il Southern blot per molte applicazioni. Tuttavia, il Southern blot rimane una tecnica utile in alcune situazioni specifiche, soprattutto quando è necessario determinare la dimensione e l'abbondanza di una sequenza bersaglio nel DNA genomico.
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